从非糖物质（如乳酸、甘油与生糖氨基酸）生成葡萄糖或糖原的反应称为糖异生途径。它主要在肝脏与肾皮质进行。糖异生途径基本上是糖酵解的逆反应过程，但由于己糖激酶、磷酸果糖激酶与丙酮酸激酶所催化的反应不可逆，故该三步反应的逆过程需要另外的酶催化，即要通过三个“能障”。另外由于草酰乙酸不能自由出入线粒体内膜，因此还要涉及一个“膜障”。
现举丙酮酸的糖异生为例：
① 酮酸→烯醇式丙酮酸：由于丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化的两步反应，构成一条“丙酮酸羧化支路”以促成丙酮酸一草酰乙酸一磷酸烯醇式丙酮酸。
② 1,6-二磷酸果糖→6-磷酸果糖
③ 6-磷酸葡萄糖→葡萄糖
④ 膜障：草酰乙酸 苹果酸 天冬氨酸
糖异生途径的生理意义：
①主要能在机体空腹或饥饿时保持血糖水平的相对稳定。
②进食后肝细胞可直接利用丙酮酸等三碳化合物以补充肝糖原，称为糖原合成的三碳途径。
③调节酸碱平衡。长期饥饿时，肾的糖异生增强，有利于酸碱平衡的维持。
