常用的细胞克隆化方法有哪些？简述其主要技术环节

主要方法有：稀释铺板法、饲养层克隆法、琼脂克隆法、毛细管克隆法、荧光激活分选法等。
稀释铺板法：也称为有限稀释法。其原理是通过适当的稀释达到分离单个细胞的目的。将培养的细胞进行计数，用培养液进行稀释到5～10个细胞/ml后，在多孔培养板（一般为96孔板）各孔内分别加入细胞悬液0.1～0.2ml，使孔内落入细胞的几率为每孔一个细胞。镜检每孔所含细胞数，标记含单个细胞的孔，培养一段时间后，凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞。常规使用中，一般不进行镜检，多采用多次克隆化培养得到单细胞的克隆系。
饲养层克隆法：对一些生长缓慢的细胞（如杂交瘤细胞），单个细胞或密度极低时细胞难以存活和增殖，在培养皿中加入能贴壁生长的其他细胞（称为饲养细胞），这些细胞不仅能起到饲养作用，还能清除培养体系中的死、伤细胞及其碎片。饲养细胞的存在可以促进单个细胞生长为细胞克隆，达到克隆化目的。常用的饲养细胞有成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。巨噬细胞不仅能起饲养作用，还能清除培养体系中死、伤细胞及其碎片。
琼脂克隆法：将细胞培养在软琼脂形成的半固体培养基上，单个细胞可在半固体的培养基上增殖形成集落。常用的软琼脂法是在培养皿中先铺一层0.5%的琼脂，待凝固后再铺一层0.25%的软琼脂，加入的细胞数要在几率上使长出的集落是一个细胞的后代。长出集落后，再转移到其他培养器中进行扩增分析。
毛细管克隆法：毛细管克隆细胞法是最早的单细胞分离培养技术。其基本过程是：在倒置显微镜下，用弯头毛细管或借助显微操作仪将细胞逐个吸出，分别放入96孔板内培养形成克隆。本法虽比较精确，但过程较繁琐，成功率低，现已少采用。
荧光激活分选法：将细胞标上荧光，当细胞悬液流经激活分选仪喷嘴时形成含有单细胞的液滴，细胞受激光照射发出荧光和前向散射光。通过仪器分析，使细胞带上电荷并使细胞流动方向发生偏移，各个含单细胞的液滴被分别收集在96孔板各孔内，以达到克隆化的目的。

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