DHPLC的填料由一个具有惰性物化性质的固定相和PS-DVB微孔球共价连接而成，采用具有疏水性的又带正电荷的TEAA作为“桥分子”，使DNA片段能够被吸附在固定相上。DHPLC的流动相为有机溶剂乙氰，双链DNA分子被吸附在固定相上，通过改变流动相中乙氰的浓度，不同片段长度的DNA分子被逐步洗脱，从而实现DNA片段的分离。洗脱下来的DNA片段一般通过紫外检测，波长254nm，而不需要进行费时的凝胶电泳分析。
当柱温<50℃时，根据双链DNA分子的链长度来的分离。当70℃>柱温>50℃时，根据双链分子的序列进行分离，这时可用于杂合双链分子与纯合双链分子的分离。当柱温>70℃时，依据单链DNA分子的碱基组成和片段长短进行分离。
