在离心前于离心管内先装入连续或不连续的密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部同梯度液一起离心，控制离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内形成一系列区带，达到各组份彼此分离的目的。
特点：
（1）样品在介质顶部。
（2）最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρ＞ρ0。样品溶液的密度<梯度密度最小值。
（3）离心时间要严格控制，既要有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在所有粒子一起沉淀。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。
（4）分离依据是个组分之沉降系数。
（5）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系数，介质黏度及梯度范围和形状的影响。
